Nació en Belmonte ( Cuenca) en 1527. Cursó sus primeros estudios en Madrid y Valladolid y pasó más tarde a la Universidad de Salamanca. Al poco tiempo de llegar a dicha ciudad, ingresó en la orden de los Agustinos. A partir de entonces quedó vinculado a la universidad el resto de su vida.

A los 32 años se le confió su primera cátedra. La rivalidad existente entre las órdenes religiosas que ocupaban los importantes puestos de la universidad  y los diferentes puntos de vista sobre diversos problemas teológicos provocaron que se viera envuelto en un proceso inquisitorial en 1572.

El Santo Oficio le acusó de defender el texto hebreo del Antoguo Testamento frente a las versiones latinas de la Vulgata y de haber efectuado una versión en castellano del Cantar de los Cantares a pesar de las prohibiciones del Concilio de Trento. Fue declarado inocente cinco años después y fue devuelto a la Universidad de Salamanca. Cuenta la tradición que se dirigió a sus alumnos con la conocida fórmula "Decíamos ayer..."

Murió en 1591 en Madrigal de las Altas Torres (Ávila).

Aunque se le incluye en la poesía mística del siglo XVI, realmente Fray Luis era demasiado intelectual para ser místico. La poesía de Fray Luís muestra siempre ese dolor por la incapacidad de alcanzar la unión mística. De esta manera queda en un plano ascético. Para lograr el estado mítico, hay que liberarse de la razón y Fray Luís no concibe una contemplación superior a la actividad racional, por lo que no alcanza el estado mítico de San Juan de la Cruz o Santa Teresa de Jesús.

La obra poética de Fray Luís se publicó póstumamente. Fue Francisco de Quevedo en 1631 quien se encarga de publicar sus obras como contrapunto al culteranismo y respeta la clasificación que hizo Fray Luís antes de morir:

- Poesías originales.

- Traducciones profanas.

- Versiones de textos sagrados.